Nuôi cấy mô thực vật là phương pháp hiệu quả để nhân giống với số lượng nhiều, hàng loạt, đồng đều, và sạch bệnh. Chúng được nuôi trong điều kiện vô trùng, đòi hỏi nhiều kỹ thuật hơn so với chăm sóc bên ngoài. Do đó, những vấn đề thường gặp phải khi nuôi cấy sẽ được nêu ra trong bài viết này.
Các vấn đề phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật
1. Vấn đề nhiễm mẫu
Tạp nhiễm, hay mẫu bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình nuôi cấy mô. Nuôi cấy mô có thành công hay không đòi hỏi phải không có tạp nhiễm. Nguồn nhiễm có thể từ nước, mẫu, dụng cụ thao tác, tủ cấy, hoặc phòng cấy...
- Ở giai đoạn vào mẫu, mẫu cần được vô trùng cẩn thận, vì nguồn nhiễm bẩn cũng chính từ đây. Mẫu có thể là lá, thân, đỉnh sinh trưởng, phát hoa hay rễ non. Tuy nhiên, để mẫu sống và phát triển trong điều kiện vô trùng thì cần phải vô trùng mẫu. Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy của mẫu. Thậm chí, vi khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy. Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy. Một số vi khuẩn thường gây nhiễm như: Pseudomonas, Agrobacterium, Acinebacter, Aerococcus, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, ….
- Điều kiện trồng cây và vị trí lấy mẫu từ cây là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm bẩn hơn ngoài đồng ruộng. Các bộ phận như rễ, củ, hoặc thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác. Do đó, để hạn chế vấn đề nhiễm bẩn từ môi trường, người ta thường đưa cây vào môi trường sạch trước 1 -2 tháng để nuôi dưỡng, nhằm loại bỏ bớt các nguồn nhiễm bẩn.
- Môi trường trong phòng cấy hoặc phòng nuôi cấy rất quan trọng, ví nếu chúng nhiễm khuẩn có thể dẫn đến nhiễm hàng loạt các mẫu nuôi cấy.
- Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều. Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy. Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài nấm thường gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra.
- Côn trùng, đặc biệt là ve bét là mối nguy hiểm tìm tàng, chúng có nhiều loài khác nhau: Dermataphagoides pteronyssimus, Dermataphagoides farinae và Tyropharus putrescentiae… Ve bét có thể sống trong ống dẫn của máy điều hòa không khí, góc phòng, dưới kệ nuôi cấy. Nó hoạt động tích cực hơn vào lúc xế chiều ở những nơi có độ ẩm và chất hữu cơ. Vòng đời của chúng kéo dài 2 tuần. Khi cấy, ta thường không phát hiện, nhưng sau vài ngày ta sẽ thấy những rãnh đường trên bề mặt bình nuôi cấy và trên bề mặt môi trường, đó là đường di chuyển của chúng. Ve bét xâm nhập vào vào bình nuôi cấy bằng cách chui qua các khe hở miệng bình, khi chúng xâm nhập chúng cũng mang theo nấm làm bình nuôi cấy vừa nhiễm nấm và ve bét cùng lúc. Một điều thường thấy là mẫu cấy bị thối nhũn và chết khi chúng xâm nhập sau khoảng 2 tuần.
2. Vấn đề xảy ra khi cây trao đổi chất với môi trường: tiết ra chất độc hại
- Xung quanh mẫu mô là các mảng hóa nâu chính là quá trình oxy hóa của các hợp chất phenolics, hậu quả là làm tổn thương mô thực vật, và ngăn chặn quá trình hấp thụ dinh dưỡng của cây. Chất Quinones được sản sinh ra do quá trình oxy hóa hợp chất phenolics, quinones gây độc cho cây, quinones phát tán xung quanh cây gây hoại tử và chết cây mô.
- Để hạn chế quá trình hóa nâu môi trường, người ta sử dụng các hóa chất như Pvp, than hoạt tính, vitamin C(L-ascorbic acid). Những chất này làm giảm quá trình hóa nâu của hợp chất phenolics.
- L-ascorbic acid còn kích thích quá trình phân chia và tạo chồi. Do đó, nó không chỉ hạn chế quá trình hóa nâu mà còn tăng trưởng về số lượng chồi. Ascorbic acid được thêm vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ: 50mg/L – 100mg/L .
- Than hoạt tính (charcoal active) giúp hút các chất độc do quá trình đào thải của cây tiết ra môi trường xung quanh. Lượng than hoạt tính được thêm vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ: 0.5 mg/L – 3/L .
3. Chọn lựa môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy mô quyết định đến thành công của cả quá trình nuôi cấy. Do đó, quá trình nuôi cấy một loài mới cần phải có sự thử nghiệm, thay đổi và cải tiến thành phần trong môi trường nuôi cấy. Các thành phần trong môi trường nuôi cấy đã được viết ở đây
4. Hiện tượng thủy tinh thể
Trong nuôi cấy mô thực vật thường thấy xuất hiện hiện tượng thủy tinh thể, khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây non dễ bị mất nước và có tỉ lệ sống rất thấp. Nó là một dạng bệnh lý, thường thấy khi nuôi ở dạng môi trường lỏng hoặc môi trường thạch nhưng hàm lượng thạch thấp.
Hiện tượng thủy tinh thể xuất hiện đặc biệt khi có sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung vào trong cây.
Đặc điểm nhận dạng cây thủy tinh thể
Bằng cảm quan, ta có thể thấy sự khác nhau về hình thành lớp sáp ở nuôi cấy mô, và cây tự nhiên. Lượng sáp chứa trong cây ngoài vườn ươm cao hơn hẳn cây in vitro. Tế bào có chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước gắn trên nó, gia tăng độ mất nước và tốc độ hô hấp của tế bào trong nhân vô tính và đưa đến sự chết của mô trong nuôi cấy.
Ngăn chặn quá trình thủy tinh thể bằng cách nào?
Việc ngăn chặn quá trình thủy tinh thể giúp cho cây có tỉ lệ sống sót cao. Dưới đây là 6 cách ngăn chặn quá trình này.
- Giảm sự hút nước bằng cách tăng nồng độ đường
- Giảm sự tăng hấp thụ nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, nhưng phương pháp này làm thay đổi sự tổng hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi.
- Giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất. ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng
- Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy
- Chuyển cây in vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng đến cây bị thủy tinh thể.
- Giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt + tăng nồng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy.
Các vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô thực vật
4/
5
Oleh
Nuôi Cấy Mô Thực Vật
