TÓM TẮT
Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) là dược liệu quý được sử dụng trongcác bài thuốc cổ truyền của cộng đồng các dân tộc thiểu số ở Việt Nam. Các loài lan kim tuyến phânbố rộng nhưng số lượng cá thể ngoài tự nhiên không nhiều do khả năng tái sinh chậm, đòi hỏi điều kiệnsống ngặt nghèo, ngoài ra, lan kim tuyến đang bị khai thác quá mức do có nhiều dược tính quý. Nghiêncứu được tiến hành nhằm xây dựng quy trình nhân in vitro loài lan kim tuyến thông qua protocorm-likebodies (PLBs) với mục đích góp phần bảo tồn loài lan quý hiếm. Tỷ lệ cảm ứng tạo PLBs đạt 86,25%với nguồn mẫu là lát cắt ngang thể chồi. Khối lượng tươi trung bình của cụm PLBs sau 30 ngày nuôicấy đạt 0,23 gam. Các cụm PLBs được nuôi cấy trên môi trường phát sinh và sinh trưởng chồitrong 30 ngày. Các chồi hình thành được tách riêng và chuyển sang giai đoạn tạo rễ. Quá trình tạorễ bao gồm 2 giai đoạn, mỗi giai đoạn kéo dài trong 30 ngày. Sau 60 ngày, 100% chồi tạo rễ vớitrung bình 3,20±0,67 rễ/chồi, chiều cao cây trung bình đạt 4,57±0,85 cm với 4,21±0,42 lá/cây. Hệ số nhân chồi của toàn bộ quy trình đạt 29,66±4,04 chồi/cụm PLBs.
Từ khóa: Anoectochilus setaceus, hệ số nhân chồi, protocorm-like bodies (PLBs), tạo chồi từ PLBs, in vitro
MỞ ÐẦU
Lan kim tuyến, Anoectochilus setaceusBlume, thuộc họ Phong lan (Orchidaceae), được biết đến nhiều do khả năng ứng dụng trong y dược.Theo y học cổ truyền Trung Hoa, lan kim tuyếnđược dùng để điều trị bệnh tiểu đường, làm tankhối u, giảm lipase trong máu và chữa viêm gan[5]. Lan kim tuyến là nguồn dược thảo quý, cógiá kinh tế cao. Nhưng do số lượng ít, mọc rảirác và bị khai thác quá mức (với hình thức khaithác tận diệt) nên cây lan kim tuyến trong tựnhiên có nguy cơ bị tuyệt chủng nếu không cóbiện pháp bảo tồn hiệu quả. Hiện nay, lan kimtuyến được đưa vào danh mục các loài đangnguy cấp thuộc nhóm IA của Nghị định32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đíchthương mại và được xếp vào nhóm thực vậtrừng đang nguy cấp (EN A1 a,c,d) trong SáchÐỏ Việt Nam 2007 [1]. Hiện tại, ở Việt Nam đãthống kê được 12 loài lan kim tuyến, trong đóloài Anoectochilus setaceus Blume thường gặpnhất và có giá trị thương mại cao nhất, gấp hàngchục lần các loài khác [7].
Hiện nay, các loài lan kim tuyến không chỉđược nghiên cứu về hoạt tính sinh học mà cònvề các phương pháp nuôi cấy in vitro. NguyễnQuang Thạch và Phí Thị Cẩm Miện (2012) [11] đã thiết lập quy trình nhân nhanh in vitro hoàn chỉnh loài lan kim tuyến Anoectochilus setaceusvới nguyên liệu là chồi và mắt đốt ngang thânvới hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu, tỷ lệ ra rễin vitro đạt 100% với trung bình 4,21 rễ/chồi.Ket et al. (2004) [4] đưa ra quy trình nhânnhanh lan kim tuyến loài Anoectochilusformosanus bằng phương pháp tạo đa chồi vớinguồn mẫu ban đầu là chồi đỉnh, hệ số nhậnchồi đạt 11,1 chồi/mẫu và 100% mẫu chồi ra rễtrên môi trường có bổ sung 0,5 g/L than hoạttính. Yih jun shiau et al. (2002) [12] nghiên cứubảo tồn loài lan kim tuyến Anoectochilusformasanus bằng phương pháp nuôi cấy hạt lainhân tạo bằng phương pháp in vitro. Hạt 7 ngàytuổi được khử trùng sau đó nuôi cấy trong điềukiện in vitro, tỷ lệ hạt sống sót, nảy mầm lênđến 77,9% và đến 90% cây sống sót, tiếp tụcsinh trưởng trong vườn ươm.
Ở Việt Nam, một số công trình nghiên cứu đã thiết lập được quy trình nhân lan kim tuyếnbằng chồi và đốt thân [4, 8, 10], tuy nhiên, việcnhân nhanh lan kim tuyến thông qua cảm ứng tạo PLBs chưa được quan tâm và nghiên cứunhiều. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiêncứu này với mục đích thiết lập quy trình nhânnhanh lan kim tuyến Anoectochilus setaceusthông qua cảm ứng tạo PLBs nhằm gia tăng hệsố nhân chồi.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thực vật: thể chồi in vitro 30 ngày tuổi của cây lan kim tuyến, Anoectochilus setaceusBlume, do Phòng Công nghệ tế bào thực vật-Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cung cấp.
Môi trường nuôi cấy: môi trường cơ bản Knudson C bao gồm các muối đa lượng, vi lượng theo Knudson (1946) và vitamin B5 theo Gamborg (1968), bổ sung các chất điều hoà sinhtrưởng như kinetin, 2,4-D, GA3, α-NAA tùytheo từng giai đoạn nuôi cấy.
Thể chồi in vitro lan kim tuyến 30 ngày tuổi(hình 2a) được khử đỉnh sinh trưởng và chuyển vào 7 công thức môi trường cảm ứngtạo protocom có bổ sung 2,4-D và kinetin ở nồng độ khác nhau. Giai đoạn cảm ứng tạoPLBs được nuôi cấy trong điều kiện lỏng-lắc,16h chiếu sáng, nhiệt độ phòng nuôi cấy 22oC.Các cụm PLBs tốt (tươi, chắc, màu xanh, không mọng nước, không bị biến dạng) được chuyển sang môi trường tạo chồi có sự kết hợp giữa BAP, kinetin, và GA3, α-NAA và tiếp tục nuôi cấy trong 30 ngày. Sau đó, các chồi phát triển tốt, chiều cao chồi đạt từ 2-3 cm được tách riêngvà chuyển lên môi trường kích thích ra rễ. Cây in vitro hoàn thiện được đưa ra trồng thử nghiệm trong vườn ươm để đánh giá khả năng thích nghi của chồi trong điều kiện tự nhiên.
Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Số liệuthống kê phân tích theo phương pháp phân tíchphương sai ANOVA bằng phần mềm SPSS.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Ảnh hưởng của kinetin và 2,4 D tới khả nănghình thành PLBs từ thể chồi
PLBs đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân giống in vitro ở các loài lan nóichung. Các nghiên cứu trước đây cho thấy, bảnchất của PLBs là các thể phôi soma [11]. Một số con đường phát sinh PLBs như (1) phát sinh PLBs trực tiếp từ các tế bào tiền phôi [2, 3] và (2) phát sinh PLBs thông qua tạo mô sẹo: mẫu thực vật được cảm ứng tạo mô sẹo trên các môi trường chứa auxin như 2,4-D, picloram… sau đó, mô sẹo được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường có hàm lượng auxin thấp để cảm ứng tạo PLBs [6, 8, 13]
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụngbảy loại môi trường, ký hiệu Pr0-Pr6 (với nềnmôi trường chung là Knudson bổ sung 10%nước dừa và 10 g/L đường saccaroza) có bổ sung 2,4 D và kinetin ở các nồng độ khác nhau,pH=5,5 nhằm lựa chọn môi trường phù hợp choquá trình tạo PLBs từ thể chồi lan kim tuyến. Chúng tôi nhận thấy, các mẫu thể chồi cảm ứng tạo PLBs tốt khi nuôi cấy trong điều kiện lỏng,lắc.
Kết quả thí nghiệm cho thấy, môi trường Pr0 (không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng), sau 30 ngày nuôi mỗi mẫu hình thành 1-2 chồi,không hình thành PLBs (bảng 1).
Trong môi trường nuôi cấy bổ sung đồngthời 2 loại chất điều hòa sinh trưởng Pr1, Pr2,Pr3 (0,5 mg/L 2,4-D và kinetin ở các nồng độ khác nhau 1,5; 1,0 và 0,5 mg/L) sau 7 ngày nuôicấy bắt đầu cảm ứng hình thành PLBs. Tỷ lệ tạo thành PLBs cao nhất ở môi trường Pr3 (84,25%). Sau 30 ngày nuôi cấy, trên cả 3 môitrường bổ sung chất điều khiển sinh trưởng đềuthu được các cụm PLBs có khối lượng tương đương nhau: 0,151; 0,153 và 0,160 gam, cáccụm PLBs có màu trắng sáng và phồng to. Tuy nhiên, khi chúng tôi cấy chuyển cụm PLBs thuđược ở trên vào môi trường kéo dài chồi thìnhận thấy không có sự hình thành chồi. Như vậy, sự kết hợp giữa 2,4 D (0,5 mg/L) và kinetin(0,5; 1,0 và 1,5 mg/L) tuy tạo ra các cụm PLBs nhưng lại không kéo dài được chồi từ cụm PLBs.
Trong khi đó, ở các môi trường bổ sung kinetin đơn lẻ với các nồng độ khác nhau (0,5;1,0; 1,5 mg/L), sự hình thành PLBs cũng nhưchất lượng PLBs có sự khác biệt rõ rệt. Môi trường Pr6 có sự hình thành PLBs sớm hơn (sau 10 ngày) so với môi trường Pr4 và Pr5 (sau 12ngày), nhưng lại có tỷ lệ hình thành PLBs thấp nhất. Môi trường Pr4 (bổ sung 0,5 mg/Lkinetin) có tỷ lệ hình thành PLBs cao nhất, các cụm PLBs có khối lượng lớn nhất và chất lượngtốt nhất, thể hiện ở: PLBs khỏe, màu trắng xanh,nhiều thể chồi (hình 2c). Như vậy, việc bổ sungcytokinin đơn lẻ (kinetin: 0,5 mg/L) trong môi trường nuôi cấy có khả năng cảm ứng tốt nhất tạo PLBs trực tiếp từ đỉnh chồi Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus.
Bảng 1. Tỷ lệ tạo thành PLBs và chất lượng PLBs trên các môi trường nghiên cứu
(*). Kết quả trung bình của 3 lần lặp lại; các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt ởmức ý nghĩa 5%
Khả năng sinh trưởng của PLBs trong môitrường Pr4
Quá trình nuôi lỏng cảm ứng tạo PLBs chịuảnh hưởng của nhiều yếu tố như chế độ nuôi,thời gian nuôi. Với chế độ nuôi lắc cố định, thờigian nuôi cấy hay thời gian thu mẫu PLBs để tiến hành tái sinh cây hoàn chỉnh có ảnh hưởnglớn đến chất lượng của cây con. Chúng tôi tiến hành theo dõi quá trình sinh trưởng của các cụm PLBs nuôi cấy trên môi trường Pr4 trong thời gian 33 ngày. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần gồm 3 bình nuôi cấy với 9,0 g mẫu thể chồi đã khử đỉnh sinh trưởng.
Kết quả cho thấy, sự gia tăng khối lượng tập trung mạnh nhất ở giai đoạn 27-30 ngày sau nuôi cấy, khối lượng PLBs tăng gấp đôi so với giai đoạn 9 ngày tuổi và khối lượng tươi tăng xấp xỉ 2,62 lần so với khối lượng mẫu cấy. Số PLBs tạo thành và phát triển kháđồng đều, ổn định qua các giai đoạn nuôi cấy. Bắt đầu từ ngày thứ 21 đến ngày thứ 30, PLBs bước vào thời kỳ tăng sinh nhanh, mạnh. Sau nuôi cấy 29-30 ngày, một số PLBs bắt đầu biệt hóa thành chồi nhỏ.
Sau 30 ngày nuôi cấy khối lượng tươi cáccụm PLBs thu được là 23,64 gam, cụm PLBschắc khỏe, có màu trắng xanh . Giai đoạn từ ngày 30-33 ngày PLBs vẫn tăng sinh tuy tốc độ tăng có chậm hơn giai đoạn 27-30 ngày, có hiện tượng thủy tinh thể ở một số PLBs. Khi chuyển cụm PLBs này vào môi trường tạo chồi, những PLBs bị thủy tinh thể không kéo dài thành chồi. Chúng tôi đã chuyển PLBs nuôi cấy 25-33 ngày vào môi trường tạo chồi. Kết quả chuyển PLBs 29-30 ngày sau nuôi cấy thời gian kéo dài chồi ngắn nhất (30 ngày),tỷ lệ tạo chồi 100%, chất lượng chồi tốt nhất. Vì vậy, chúng tôi chọn thời gian nuôi cảm ứng tạo PLBs là 30 ngày.
Tái sinh cây hoàn chỉnh từ PLBs
Các cụm PLBs 30 ngày tuổi tạo ra từ môi trường Pr4, có khối lượng trung bình 0,23 gam được chuyển vào nuôi cấy trên các môi trường K0(knudson C + 10% nước dừa + 10% dịch chiết khoai tây + 30 g/L saccaroza + 2,7 g/L gelrite),K1 (K0 + 0,5 mg/L BAP + 0,3 mg/l GA3 + 0,3mg/L kinetin + 0,1 mg/L NAA [8, 9] và K2 (K0+ 0,5 mg/L NAA). Các môi trường K0, K1, K2đều có pH=5,5, nhằm đánh giá khả năng phátsinh, sinh trưởng và tạo cây hoàn chỉnh từ PLBs lan kim tuyến.
Chúng tôi tiến hành tái sinh cây lan kim tuyến từ PLBs theo hai giai đoạn. (1) Giai đoạntái sinh chồi từ PLBs và (2) Giai đoạn sinhtrưởng chồi và tạo rễ.
Ở giai đoạn (1), các cụm PLBs được chuyển lên môi trường K0 hoặc K1 để tái sinh chồi từcụm PLBs. Sau 7-10 ngày nuôi cấy chúng tôinhận thấy đã tạo được chồi từ PLB (hình 2d) vàsau 30 ngày nuôi cấy các cụm PLBs hình thành các chồi cao 0,5-2,5 cm, có từ 1-2 lá, chồi có màu trắng-xanh (hình 2e). Kết quả sau 30 ngàynuôi cấy trên môi trường K0 có hệ số nhân chồicao hơn nuôi trong môi trường K1 (22±3,76chồi/cụm PLBs so với 20,14±4,14 chồi/cụm PLBs). Tuy nhiên, sự sai khác về hệ số nhân chồigiữa K0 và K1 không có ý nghĩa về mặt thống kênên chúng tôi chưa chọn môi trường thích hợp cho giai đoạn tái sinh chồi từ PLBs. Kết thúc giai đoạn 1, với thời gian nuôi cấy tái sinh chồi 30 ngày, nhiều chồi vẫn nhỏ, có thể chưa kéo dài hếtchồi ở cụm PLBs, nhưng nếu tiếp tục nuôi trong môi trường tạo chồi thì ảnh hưởng đến chất lượng cây con nên chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy giai đoạn (1) là 30 ngày
Bảng 2. Khả năng tạo cây hoàn chỉnh và hệ số nhân chồi của toàn qui trình nuôi cấy
(*). Kết quả trung bình của 3 lần lặp lại; các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt ởmức ý nghĩa 5%.
Trong giai đoạn (2), chúng tôi tách cụm chồi(3-4 chồi) từ cụm chồi đã tái sinh từ một cụm PLBs thu được ở giai đoạn (1) chuyển sang môi trường K0 hoặc K2 để chồi tiếp tục sinh trưởng. Sau 30 ngày nuôi cấy đầu tiên, chúng tôi tiến hành tách riêng từng chồi và chuyển sang cùngmôi trường để chồi sinh trưởng và ra rễ
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, chúngtôi nhận thấy, môi trường không bổ sung chấtđiều hòa sinh trưởng K0 cũng có khả năng cảmứng tạo rễ ở các chồi lan kim tuyến. Do đó,chúng tôi tiến hành nuôi cấy các chồi riêng biệt trên cả hai môi trường K0 và K2 trong giai đoạn(2). Giai đoạn (2) kéo dài trong 60 ngày. Kết quả theo dõi sau 90 ngày được thể hiện ở bảng 2.
Kết quả cho thấy, khi tách chuyển các cụmchồi nuôi cấy trong hai môi trường K0 và K1 ởgiai đoạn (1) vào cùng một môi trường tạo rễ(K0 hoặc K2) ở giai đoạn (2), hệ số tạo chồi cósự sai khác lớn
Khi chuyển các cụm chồi từ nuôi cấy trongmôi trường K0 sang môi trường sinh trưởng vàtạo rễ K0 không thấy có sự sai khác nhiều về hiệu quả tạo chồi. Nguyên nhân có thể do môi trường tái sinh chồi K0 (không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng) các cytokinin ngoại sinh được cây sử dụng hết trong giai đoạn (1), sau 30 ngày nuôi cấy chuyển sang môi trường sinh trưởng chồi và tạo rễ K0 hoặc K2 (không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thuộc nhómcytokinin) trong mẫu cấy chỉ còn cytokinin nộisinh, nên ở giai đoạn này cây gần như không tạo thêm chồi công thức K0-K0 có hiệu suất nhân cây là 22,5 trong khi kết quả tương tự từ côngthức K0-K2 là 23,00). Bên cạnh đó, các chồi tạo thành có chất lượng đồng đều. Ðiều này thể hiện ở chiều cao chồi và số lá/cây giữa 2 công thức không có sai khác rõ rệt (bảng 2). Tuy nhiên, việc bổ sung 0,5 mg/l NAA ở môi trường K2 cho số lượng rễ/chồi (3,92 rễ/chồi ) cao hơnở môi trường K0 (3,07 rễ/chồi).
Khi chuyển các cụm chồi từ môi trường K1 ở giai đoạn (1) sang môi trường K2 hay K0 đều có hiệu suất nhân cây (số cây/cụm PLBs) caohơn các cụm chồi được chuyển từ môi trườngK0. Hiệu suất nhân cây tăng do trong 30 ngàyđầu giai đoạn (2), các cụm chồi được tách từ môi trường K1 vẫn tiếp tục tạo chồi (hình 2f). Hiện tượng này có thể do khi chồi sinh trưởng trong môi trường tái sinh chồi K1 (bổ sung chấtđiều hòa sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin) khichuyển sang môi trường mới ở giai đoạn (2) các cụm chồi vẫn còn dư lượng chất kích thích cytokinin nên tiếp tục hình thành chồi nách,đồng thời kéo dài hết các chồi bắt đầu hìnhthành từ môi trường tái sinh chồi mà chưa đếmđược. Công thức K1-K2 cho hiệu suất nhân cây cao nhất 38,33 cây. Tuy nhiên, cây con tạo thành có chất lượng thấp (số rễ/cây, chiều caocây, số lá/cây ít và không đồng đều) không đủ điều kiện đưa ra vườn ươm. Trong khi đó, côngthức K1-K0 sau 60 ngày nuôi cấy cho chấtlượng cây con tốt hơn và đủ tiêu chuẩn đưa ra vườn ươm với hiệu suất nhân cây đạt 29,66 cây/cụm PLBs với 100% chồi tạo rễ và trungbình tạo 3,2 rễ/ chồi, các chồi đạt chiều caotrung bình 4,57cm và có 4,21 lá/cây (hình 2g).Căn cứ vào những phân tích trên, chúng tôi chọn môi trường K1 (bổ sung 0,5 mg/L BAP +0,3 mg/L GA3 + 0,3 mg/L kinetin + 0,1 mg/LNAA) là môi trường tái sinh chồi và môi trường K0 (không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng) là môi trường sinh trưởng và tạo rễ của chồi khixây dựng quy trình nhân lan kim tuyến.
Nguyễn Quang Thạch và Phí Thị Cẩm Miện(2012) [10] đã thiết lập quy trình nhân nhanh invitro hoàn chỉnh loài lan kim tuyếnAnoectochilus setaceus với nguyên liệu là chồivà mắt đốt ngang thân với hệ số nhân chồi là6,55 chồi/mẫu. Trương Thị Bích Phượng, PhanNgọc Khoa (2013) đã nhân thành công lan kim tuyến qua nuôi cấy cụm protocorm (2,0 × 2,0mm) được hình thành từ hạt cho hệ số nhân là 5,62 chồi/cụm protocorm với tổng thời giannuôi cấy là 32 tuần [8]. Như vậy, chúng tôi bước đầu đã tạo được qui trình nhân nhanh lan kim tuyến Anoectochilus setaceus thông qua cảm ứng tạo PLBs với hiệu suất nhân cây cao 29,66 chồi/cụm PLBs
Ðánh giá khả năng thích nghi của chồi lankim tuyến in vitro ngoài vườn ươm
Ðánh giá khả năng sống của cây lan kimtuyến khi chuyển ra giá thể trồng là khâu quan trọng để đánh giá hiệu quả của qui trình nhân giống in vitro. Chính vì vậy chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm chuyển 100 cây lan kim tuyến nuôi cấy in vitro ra trồng trong vườn ươm (có mái che). Trồng bằng phương pháp thủy canh với giá thể là sợi xơ dừa hoặc trồng trên giá thểlà than củi + vỏ thông + rêu với tỷ lệ phối trộnlà 3:2:1 hoặc trên giá thể rêu + than với tỷ lệ4:1. Thời gian trồng 6 tuần. Kết quả trồng thủy canh cho thấy, tỷ lệ sống sót ngoài vườn ươm xấp xỉ 100% (hình 2h). Trong khi đó, trồng trêngiá thể than củi + vỏ thông + rêu, tỷ lệ cây sốngthấp hơn, khoảng 96%. Thấp nhất là cây trồng trên giá thể rêu + than, tỷ lệ cây sống chỉ khoảng 80%. Toàn bộ cây còn sống đều sinh trưởng và phát triển bình thường, cây ra rễ và lámới. Với tỷ lệ cây trồng trong vườn ươm sống là 80%-100% tùy môi trường ươm, toàn bộ câycòn sống đều ra rễ và lá mới đã chứng minh câylan kim tuyến nuôi cấy in vitro thông qua tá isinh PLBs có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt trong điều kiện vườn ươm
KẾT LUẬN
Chúng tôi đã nghiên cứu hoàn thiện quytrình tái sinh cây lan kim tuyến, Anoectochilussetaceus Blume, thông qua PLBs như sau
huẩn bị vật liệu in vitro để cảm ứng tạoPLBs: nuôi đốt thân lan kim tuyến trong môitrường pr4, 30 ngày để thu chồi
Cảm ứng tạo PLBs: môi trường thích hợpnhất để cảm ứng tạo PLBs là Pr4 (Knudson cơbản + 0,5 mg/L kinetin + 10 g/L đườngsaccaroza + 10% nước dừa, pH=5,5). Cắt chồi,bỏ đỉnh chồi, nuôi trong môi trường pr4 sau 30ngày thì thu PLBs. Tỷ lệ tạo PLBs là 86,25%,khối lượng trung bình của cụm PLBs sau 30ngày nuôi cấy là 0,23 gam/cụm PLBs, PLBs thuđược có chất lượng tốt.
Tái sinh cây hoàn chỉnh từ PLBs: tái sinhcây lan kim tuyến từ PLBs theo hai giai đoạn.(1) Giai đoạn tái sinh chồi từ PLBs. (2) Giaiđoạn sinh trưởng chồi và tạo rễ.
(1) Giai đoạn tái sinh chồi từ PLBs: chồiđược tái sinh trên môi trường Knudson C bổsung 10% nước dừa,10% dịch chiết khoai tây,30 g/L đường saccaroza, 0,5 mg/L BAP, 0,3mg/l GA3, 0,3 mg/L kinetin, 0,1 mg/L NAA và2,7 g/L gelrite, pH=5,5
(2) Giai đoạn sinh trưởng chồi và tạo rễ:Các chồi sinh trưởng và tạo rễ hình thành câyhoàn chỉnh trên môi trường knudson C cơ bảnbổ sung 10% nước dừa, 10% dịch chiết khoaitây, 2,7 g/L gelrite và 30 g/L đường saccaroza,pH=5,5
Bước đầu cho thấy, phương pháp trồng thủycanh trên giá thể xơ dừa phù hợp cho giai đoạntập huấn cây trong vườn ươm. Cây lan kimtuyến sinh trưởng ổn định, phát triển tốt, ra rễvà lá mới cho tỷ lệ sống sót cao. Bằng phươngthức phát triển cây thông qua giai đoạn cảm ứngtạo PLBs trong một thời gian ngắn (120 ngày)có thể nhân nhanh loài Lan kim tuyến,Anoectochilus setaceus, với hiệu suất nhân cao(29,66 chồi/cụm PLBs 0,23 gam). Cây giốngthu được từ quy trình có tỷ lệ sống cao (80%-100%), cây con sinh trưởng bình thường khichuyển ra vườn ươm
Lời cảm ơn: Công trình được thực hiện trongkhuôn khổ đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứuphát triển công nghệ chiếu sáng LED phục vụnông nghiệp Tây Nguyên” thuộc chương trìnhTây Nguyên 3 “Khoa học và công nghệ phục vụphát triển kinh tế-xã hội vùng Tây Nguyên"-TN3/C09. Các thí nghiệm được tiến hành có sửdụng trang thiết bị của Phòng thí nghiệm trọngđiểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa họcvà Công nghệ Việt Nam, 2007. Sách ÐỏViệt Nam. Phần II. Thực Vật. Nxb. Khoahọc tự nhiên và Công nghệ, 611 trang.
2. Chong- Siang Tee, Ching- Qing Wong, Xui-Lai Lam, Mahmood Maziah, 2010. Apreliminary study of protocorm- like- bodies(PLBs) induction using leaf explants ofVanda and Dendrobium orchids. AsPac J.Mol. Biol. Biotechn., 18(1): 189-191.
3. Juliana Lischka Sampaio Mayer, GiulioCesare Stancato, Beatriz Appezzato-Da-Glo´ria, 2010. Direct regeneration ofprotocorm-like bodies (PLBs) from leafapices of Oncidium flexuosum Sims(Orchidaceae). Plant Cell Tiss Organ Cult.
4. Nguyen Van Ket, Hahn E. J., Park S.Y.,Chakrabarty D., Paek K. Y., 2004.Micropropagation of an endangered orchidAnoectochilusformosanus.BiologiaPlantarum, 48(3): 339-344.
5. Ðỗ Tất Lợi, 2004. Những cấy thuốc và vịthuốc Việt Nam. Nxb. Y học. Hà Nội, 1294 trang.
6. Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thụy MinhHạnh, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Văn Bình,Vũ Quốc Luận, 2008. Các con đường pháttriển của phôi vô tính thực vật. Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(4): 397-414.
7. Phùng Văn Phê, Nguyễn Trung Thành,Vương Duy Hưng, 2010. Ðặc điểm hìnhthái, phân bố của loài lan Kim tuyếnAnoectochilus setaceus Blume ở vườn quốcgia Tam Ðảo, tỉnh Vĩnh Phúc. Tạp chí Khoahọc ÐHQGHN, Khoa học tự nhiên và Côngnghệ, 26: 104-109.
8. Trương Thị Bích Phượng, Phan Ngọc Khoa,2013. Nhân giống in vitro cây Lan Kimtuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.)Lindl. Tạp chí Khoa học Ðại học Huế,79(1).
9. Nguyen Trung Thanh, Pham Luong Hang,Nguyen Van Ket, Truong Thi Lan Anh,Phung Van Phe, Nguyen Thi Hong Gam,Phi Thi Cam Mien, 2012. The role ofdifferent medium and plant hormones onmultiple shoots of Jewel orchids(Anoectochilus setaceus Blume). VNUJournal of Science, Natural Sciences andTechnology, 28: 47-53.
10. Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Miện,2012. Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống loàilan kim tuyến (Anoectochilus setaceusBlume) in vitro bảo tồn nguồn dược liệuquý. J. Sci. Devel., 10 (4): 597-603.
11. Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê HồngÐiệp, 2010. Công nghệ sinh học. Nxb. Giáodục, Hà Nội, 184 trang.
12. Yih-Juh Shiau, Abhay P. Sagare, Uei-ChinChen, Shu-Ru Yang, and Hsin-Sheng Tsay,2002. Conservation of Anoectochilusformosanus Hayata by artificial cross-pollination and in vitro culture of seeds.Bot. Bull. Acad. Sin., 43: 123-130.
13. Yung I Lee, Shan-Te Hsu, Edwarc C.Yeung, 2013. Orchid Protocorm LikeBodies are Somatic embryos. AmericanJournal of Botany, 100(11): 1-11
