Thứ Ba, 4 tháng 10, 2022

Các vấn đề thường gặp trong nuôi cấy mô thực vật

 Nuôi cấy mô thực vật là phương pháp hiệu quả để nhân giống với số lượng nhiều, hàng loạt, đồng đều, và  sạch bệnh. Chúng được nuôi trong điều kiện vô trùng, đòi hỏi nhiều kỹ thuật hơn so với chăm sóc bên ngoài. Do đó, những vấn đề thường gặp phải khi nuôi cấy sẽ được nêu ra trong bài viết này.



Các vấn đề phổ biến trong nuôi cấy mô thực vật

1. Vấn đề nhiễm mẫu

Tạp nhiễm, hay mẫu bị nhiễm khuẩn, nhiễm nấm làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình nuôi cấy mô. Nuôi cấy mô có thành công hay không đòi hỏi phải không có tạp nhiễm. Nguồn nhiễm có thể từ nước, mẫu, dụng cụ thao tác, tủ cấy, hoặc phòng cấy...

  • Ở giai đoạn vào mẫu, mẫu cần được vô trùng cẩn thận, vì nguồn nhiễm bẩn cũng chính từ đây. Mẫu có thể là lá, thân, đỉnh sinh trưởng, phát hoa hay rễ non. Tuy nhiên, để mẫu sống và phát triển trong điều kiện vô trùng thì cần phải vô trùng mẫu. Môi trường bên ngoài luôn có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, các rãnh nhỏ, nách lá, lớp vẩy của mẫu. Thậm chí, vi khuẩn thường nhiễm vào hệ thống mô mạch và gây nhiễm môi trường sau 1 tuần nuôi cấy. Nhiễm khuẩn trong trường hợp này thường gây những vệt trắng sữa xuất phát từ mô cấy và quan sát rõ nhất khi xem từ dưới đáy chai nuôi cấy. Một số vi khuẩn thường gây nhiễm như: Pseudomonas, Agrobacterium, Acinebacter, Aerococcus, Bacillus, Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, ….
  • Điều kiện trồng cây và vị trí lấy mẫu từ cây là yếu tố quan trọng thiết lập quá trình nuôi cấy sạch. Cây trồng trong nhà kính ít nhiễm bẩn hơn ngoài đồng ruộng. Các bộ phận như rễ, củ, hoặc thân bò thì thường khó làm sạch hơn các bộ phận khác. Do đó, để hạn chế vấn đề nhiễm bẩn từ môi trường, người ta thường đưa cây vào môi trường sạch trước 1 -2 tháng để nuôi dưỡng, nhằm loại bỏ bớt các nguồn nhiễm bẩn.
  • Môi trường trong phòng cấy hoặc phòng nuôi cấy rất quan trọng, ví nếu chúng nhiễm khuẩn có thể dẫn đến nhiễm hàng loạt các mẫu nuôi cấy. 
  • Nấm thường tồn tại dạng bào tử lơ lửng trong không khí, khi phòng nuôi có nhiều người ra vào tạo điều kiện tích lũy vi sinh vật càng nhiều. Nếu màng lọc tủ cấy không tốt sẽ gây nhiễm mẫu hàng loạt ngay trong quá trình cấy. Ngoài ra, bào tử nấm còn tấn công gây nhiễm những chai môi trường chưa sử dụng hoặc những bình đã được nuôi 2 - 3 tháng. Các loài nấm thường gặp: Aspergillus, Candida, Cladosporium, Microsprium và Phialophra.
  • Côn trùng, đặc biệt là ve bét là mối nguy hiểm tìm tàng, chúng có nhiều loài khác nhau: Dermataphagoides pteronyssimus, Dermataphagoides farinae và Tyropharus putrescentiae… Ve bét có thể sống trong ống dẫn của máy điều hòa không khí, góc phòng, dưới kệ nuôi cấy. Nó hoạt động tích cực hơn vào lúc xế chiều ở những nơi có độ ẩm và chất hữu cơ. Vòng đời của chúng kéo dài 2 tuần. Khi cấy, ta thường không phát hiện, nhưng sau vài ngày ta sẽ thấy những rãnh đường trên bề mặt bình nuôi cấy và trên bề mặt môi trường, đó là đường di chuyển của chúng. Ve bét xâm nhập vào vào bình nuôi cấy bằng cách chui qua các khe hở miệng bình, khi chúng xâm nhập chúng cũng mang theo nấm làm bình nuôi cấy vừa nhiễm nấm và ve bét cùng lúc. Một điều thường thấy là mẫu cấy bị thối nhũn và chết khi chúng xâm nhập sau khoảng 2 tuần.

2. Vấn đề xảy ra khi cây trao đổi chất với môi trường: tiết ra chất độc hại

  • Xung quanh mẫu mô là các mảng hóa nâu chính là quá trình oxy hóa của các hợp chất phenolics, hậu quả là làm tổn thương mô thực vật, và ngăn chặn quá trình hấp thụ dinh dưỡng của cây. Chất Quinones được sản sinh ra do quá trình oxy hóa hợp chất phenolics, quinones gây độc cho cây, quinones phát tán xung quanh cây gây hoại tử và chết cây mô.
  • Để hạn chế quá trình hóa nâu môi trường, người ta sử dụng các hóa chất như Pvp, than hoạt tính, vitamin C(L-ascorbic acid). Những chất này làm giảm quá trình hóa nâu của hợp chất phenolics.
  • L-ascorbic acid còn kích thích quá trình phân chia và tạo chồi. Do đó, nó không chỉ hạn chế quá trình hóa nâu mà còn tăng trưởng về số lượng chồi. Ascorbic acid được thêm vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ: 50mg/L – 100mg/L .
  • Than hoạt tính (charcoal active) giúp hút các chất độc do quá trình đào thải của cây tiết ra môi trường xung quanh. Lượng than hoạt tính được thêm vào môi trường nuôi cấy với tỷ lệ: 0.5 mg/L – 3/L .

3. Chọn lựa môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy mô quyết định đến thành công của cả quá trình nuôi cấy. Do đó, quá trình nuôi cấy một loài mới cần phải có sự thử nghiệm, thay đổi và cải tiến thành phần trong môi trường nuôi cấy. Các thành phần trong môi trường nuôi cấy đã được viết ở đây

4. Hiện tượng thủy tinh thể


Trong nuôi cấy mô thực vật thường thấy xuất hiện hiện tượng thủy tinh thể, khi chuyển ra khỏi bình nuôi cấy, cây non dễ bị mất nước và có tỉ lệ sống rất thấp. Nó là một dạng bệnh lý, thường thấy khi nuôi ở dạng môi trường lỏng hoặc môi trường thạch nhưng hàm lượng thạch thấp.

Hiện tượng thủy tinh thể xuất hiện đặc biệt khi có sự trao đổi khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung vào trong cây.

Đặc điểm nhận dạng cây thủy tinh thể

Bằng cảm quan, ta có thể thấy sự khác nhau về hình thành lớp sáp ở nuôi cấy mô, và cây tự nhiên. Lượng sáp chứa trong cây ngoài vườn ươm cao hơn hẳn cây in vitro. Tế bào có chứa nhiều phân tử có cực dễ dàng nhận phân tử nước gắn trên nó, gia tăng độ mất nước và tốc độ hô hấp của tế bào trong nhân vô tính và đưa đến sự chết của mô trong nuôi cấy.


Ngăn chặn quá trình thủy tinh thể bằng cách nào?


Việc ngăn chặn quá trình thủy tinh thể giúp cho cây có tỉ lệ sống sót cao. Dưới đây là 6 cách ngăn chặn quá trình này.

  1. Giảm sự hút nước bằng cách tăng nồng độ đường
  2. Giảm sự tăng hấp thụ nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao, nhưng phương pháp này làm thay đổi sự tổng hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi.
  3. Giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất. ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng
  4. Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy
  5. Chuyển cây in vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng đến cây bị thủy tinh thể.
  6. Giảm etylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông khí tốt + tăng nồng độ ánh sáng và giảm nhiệt độ phòng cấy.



Lúc Invitro Thực Vật

Chủ Nhật, 26 tháng 6, 2022

Dùng Citric acid để chuẩn pH trong môi trường nuôi cấy

 Dùng Citric acid để giảm độ pH của môi trường nuôi cấy 

Người ta thường dùng HCl để giảm độ pH môi trường, nhưng có một số lý do mà Citric acid có thể thay thế HCl ví dụ như HCL rất nguy hiểm, hoặc khó tiếp cận đối với cá nhân. 

Citric acid là một dạng acid yếu, không nguy hiểm đối với người sử dụng. Ngoài chức năng giảm độ pH môi trường, nó còn là một chất chống oxy hóa rất tốt cho việc nuôi cấy mô. 

Cũng có nhiều ý tưởng dùng Nitric acid để chuẩn độ pH nhưng HNO3 có nitơ, sẽ thay đổi hàm lượng nitơ tổng trong môi trường. Nếu bạn sử dụng HNO3 sẽ thay đổi dữ liệu nghiên cứu. HNO3 cũng rất nguy hiểm, nên sử dụng Citric acid là ổn nhất. 



Lúc Invitro Thực Vật

Thứ Bảy, 25 tháng 6, 2022

Môi trường MS Trung Quốc (cơ bản - Có agar và đường)

 Môi trường MS Trung Quốc (cơ bản - Có agar và đường)

  • Môi trường MS hay Murashige and Skoog medium. Hiện nay loại pha sẵn của Trung quốc có 2 loại: một là không chứa đường +agar (MS cơ bản), 2 là có chứa đường +agar. 
  • Chai MS không chứa đường và agar code PYJ002 mỗi lần xài lấy 4.74g/L, ví dụ chai MS 1,000g thì sẽ pha được gần 211 lít môi trường. Chai MS này nó sẽ lợi hơn là mua loại chứa sẵn đường và agar. Đường và agar mua riêng bên ngoài dễ có và rẻ, không cần thiết phải mua dạng tích hợp sẵn đường_agar.
  • Chai MS chứa đường và agar, code PYJ001: mỗi lần sử dụng lấy 41.74g/L, ví dụ chai MS 1,000 g thì sẽ pha tương đương 24 lít môi trường.
  • Môi trường MS này do Trung quốc sản xuất được SBC SCIENTIFIC phân phối tại Việt Nam, có giá cả cạnh tranh.




Thông tin liên hệ: 

SBC SCIENTIFIC
Hotline 0945677929
Email: [email protected]

Lúc Invitro Thực Vật

Chủ Nhật, 19 tháng 6, 2022

Nuôi cấy mô sâm bố chính (Hibiscus sagittifolius KURZ) từ hạt và đốt thân

 Tóm tắt

Sâm bố chính không những là một loài hoa đẹp mà còn là một loài cây có giá trị dược liệu cao, được sử dụng nhiều trong đông y. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm hoàn thiện quy trình vi nhân giống cây sâm bố chính từ hạt và đốt thân. Kết quả thu được cho thấy, mẫu hạt và đốt thân được khử trùng với dung dịch javel 15% trong 15 phút thu được tỷ lệ mẫu không nhiễm và sống sót đạt 71,99%. Tỷ lệ nảy mầm của hạt được nâng cao (82%) khi hạt được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch GA3 20 mg/L trong 120 phút trước khi tiến hành khử trùng. Môi trường thích hợp cho quá trình nhân nhanh chồi là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962)và chiều dài trung bình rễ đạt 13 cm sau 45 ngày nuôi cấy

MỞ ĐẦU

Sâm bố chính (Hibiscus sagittifolius Kurz) là loài cây dược liệu quý có tác dụng chữa cơ thể suy nhược, kém ăn, thiếu ngủ, đau lưng, đau mình, các chứng ho sốt nóng, trong người khô, táo bón, khát nước, gầy còm... (Đỗ Tất Lợi, 2004). Trong rễ sâm bố chính chứa phytosterol, coumarin, acid béo, acid hữu cơ, đường khử và hợp chất uronic; hàm lượng lipid là 3,96%; hàm lượng protein toàn phần là 0,23%; hàm lượng protid là 1,26%; hàm lượng tinh bột 15,14% và chất nhầy là 18,92% (chất nhầy là Dglucose và L-rhamnose). Các acid amin gồm 11 chất, trong đó có histidin, arginin, threonin, alanin, prolin, tyrosin, valin, phenylalanin và leucin; ngoài ra, còn có 13 nguyên tố khoáng cần thiết cho cơ thể (Trần Công Luận và Bùi Trần Minh Phương, 2011).


Một nghiên cứu khác về sâm bố chính cho thấy, trong rễ sâm bố chính còn chứa tinh bột và 30-40% chất nhầy (Đỗ Tất Lợi, 2004). Bên cạnh tác dụng dược liệu, sâm bố chính còn được người dân trồng làm cảnh với màu hoa khác nhau từ đỏ, hồng đến vàng. Với những công dụng và lợi ích trên mà sâm bố chính ngoài tự nhiên đang bị khai thác một cách quá mức làm cạn kiệt nguồn sâm trong tự nhiên. Do vậy, các nghiên cứu nhân giống, gây trồng loài cây này đang ngày càng được quan tâm. Trong đó, ứng dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác vi nhân giống có thể tạo ra các cây giống đồng nhất, có chất lượng tốt với số lượng lớn trong thời gian ngắn, là một giải pháp triển vọng trong quá trính phát triển loài dược liệu này, góp phần đảm bảo nguồn dược liệu cho sản xuất quy mô lớn cũng như bảo tồn loài sâm bố chính.


2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Vật liệu được sử dụng là các đoạn đốt thân sâm bố chính mang chồi ngủ có kích thước 2 cm và hạt cây sâm bố chính (Hibiscus sagittifolius Kurz) được thu nhận tại thành phố Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp, Việt Nam.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Bố trí thí nghiệm

Khảo sát ảnh hưởng của thời gian khử trùng đoạn đốt thân và hạt sâm bố chính trong dung dịch HgCl2, NaClO

Đoạn đốt thân và hạt sâm bố chính được rửa sạch với nước trong 10 phút, sau đó khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút. Tiếp theo mẫu được khử trùng với dung dịch HgCl2 0,1% và NaClO 15% ở các khoảng thời gian khác nhau: 5; 10; 15; 20 phút. Sau khi khử trùng, tiến hành cấy 2 hạt/ống nghiệm (đối với mẫu hạt) và 1 mẫu/ống nghiệm (đối với mẫu đốt thân). Mỗi nghiệm thức thực hiện 10 ống nghiệm. Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.

Ảnh hưởng của tiền xử lý GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt sâm bố chính Hạt sâm bố chính được tiền xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch GA3 ở các nồng độ khác nhau (0; 10; 20; 30; 40 mg/L) trong 2 giờ trước khi tiến hành khử trùng. Thời gian và nồng độ chất khử trùng được chọn từ công thức tối ưu nhất ở thí nghiệm trên. Ở hai thí nghiệm trên, môi trường nuôi cấy đốt thân là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung 1,0 mg/L BA, 30 g/L sucrose, 8 g/L agar, pH 5,8. Môi trường nuôi cấy hạt là MS có bổ sung 10 mg/L GA3, 30 g/L sucrose, 8 g/L agar, pH 5,8 (Phan Duy Hiệp và ctv., 2014). Tiến hành theo dõi và thu nhận số liệu sau 20 ngày nuôi cấy.

Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi sâm bố chính

Các chồi in vitro thu nhận ở thí nghiệm trên (bật chồi từ đốt thân và cây nảy mầm từ hạt) được cắt thành những đoạn thân có mang chồi bên với kích thước khoảng 1,5 cm. Sau đó, mẫu đốt thân được nuôi cấy ở môi trường MS có bổ sung 30 g/L sucrose, 100 mL/L nước dừa, 8 g/L agar, pH 5,8 (Phan Duy Hiệp và ctv., 2014) đồng thời bổ sung BA với các nồng độ khác nhau: 0, 1, 2, 3, 4 mg/L. Số liệu được thu nhận sau 45 ngày nuôi cấy.

Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây sâm bố chính

Các chồi in vitro có kích thước khoảng 3 cm thu nhận từ môi trường tối ưu ở giai đoạn nhân nhanh được tách riêng lẻ và cấy vào môi trường MS có bổ sung 30 g/L sucrose, 8 g/L agar, pH 5,8 và bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau: 0; 0,5; 1,0 ; 1,5; 2,0 mg/L. Số liệu được thu nhận sau 45 ngày nuôi cấy.


2.2.2 Điều kiện nuôi cấy

Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện nhiệtđộ 25 ± 2oC, cường độ chiếu sáng 2.500 ± 200 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, độ ẩm phòng nuôi cây 50 - 60%.

2.2.3 Xử lý thống kê

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn (CRD) với 3 lần lặp lại. Các số liệu được xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel và Statgraphic Centurion XVI với độ tin cậy 95%.

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đốt thân và hạt sâm bố chính trong dung dịch HgCl2 và NaClO

Khi sử dụng dung dịch HgCl2 0,1%, tỷ lệ mẫu không nhiễm đều đạt 100% ở cả mẫu đốt thân và hạt, nhưng tất cả các mẫu nuôi cấy đều không bật chồi hoặc nảy mầm (Hình 1, 2). Nguyên nhân là do HgCl2 là một chất khử trùng mạnh, nên không chỉ gây chết đối với vi sinh vật mà còn gây chết đối với mẫu mô tế bào thực vật. Kết quả này cũng tương tự với quan sát của Wesely et al. (2012) khi khử trùng tạo mẫu sạch từ chồi non cây ngưu tất (Achyranthes bidentata) sử dụng HgCl2 0,1% trong thời gian 5 phút cho tỷ lệ mẫu sạch đạt 100%, nhưng 95 – 100% mẫu bị chết.

Đối với nghiệm thức sử dụng NaClO 15%, kết quả khử trùng đoạn đốt thân cho thấy tỷ lệ mẫu không nhiễm đạt 71,99% và tất cả các mẫu đốt thân không nhiễm đều tạo chồi ở nghiệm thức 15 phút. Ở nghiệm thức 20 phút, tỷ lệ mẫu đốt thân không nhiễm đạt cao nhất (100%), tuy nhiên tỷ lệ mẫu bật chồi chỉ đạt 8% (Hình 1). Ở hai nghiệm thức 5 và 10 phút, tỷ lệ mẫu không nhiễm thấp, chỉ đạt lần lượt là 4 và 44% và tỷ lệ mẫu bật chồi tương ứng của hai nghiệm thức là 4% và 40%. Do đó, thời gian khử trùng mẫu đốt thân trong dung dịch NaClO thích

hợp là 15 phút. Nguyễn Văn Việt và ctv. (2016) khi nghiên cứu khử trùng mẫu đốt thân cây Aerides odorata Lour bằng NaClO cũng cho thấy, nếu khử trùng với NaClO thì thời gian khử trùng 17 phút thu được tỷ lệ mẫu sạch đạt 83,33% và tỷ lệ mẫu tái sinh là 60,67%.

Hình 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đoạn đốt thân trong dung dịch HgCl20,1% và NaClO15
Hình 1: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đoạn đốt thân trong dung dịch HgCl20,1% và NaClO15

Mẫu hạt được khử trùng với dung dịch NaClO 15% cũng thu được kết quả tương tự với mẫu đốt thân. Ở các mức thời gian từ 5 đến 20 phút, tỷ lệ mẫu hạt không nhiễm gia tăng tỷ lệ thuận với thời gian khử trùng và đạt cao nhất (88%) ở nghiệm thức 20 phút; tuy nhiên, tỷ lệ hạt nảy mầm ở nghiệm thức này thấp (14,67%). Ở nghiệm thức 15 phút, tỷ lệ hạt không nhiễm là 76% và tỷ lệ mẫu sống sót đạt cao

nhất (71,99%). Dựa trên kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian khử trùng có ảnh hưởng nhiều đến hiệu quả khử trùng và khả năng sống sót của mẫu nuôi cấy.Vì vậy, thời gian khử trùng mẫu hạt thích hợp trong dung dịch NaClO 15% là 15 phút. Theo nghiên cứu của Yildiz and Er (2002), hạt của cây lanh (Linum usitatissimum) được khử trùng bằng NaClO kết hợp với nhiệt độ 10oC sẽ cho hiệu quả tối ưu nhất với tỷ lệ nảy mầm của hạt là 100%.

Như vậy, chất khử trùng thích hợp cho cả mẫu hạt và đốt thân là NaClO 15% với thời gian khử trùng 15 phút.

Hình 2: Ảnh hưởng của thời gian khử trùng hạt sâm bố chính trong dung dịch HgCl20,1% và
NaClO15%

3.2 Ảnh hưởng của tiền xử lý GA3 đến khả năng nảy mầm của hạt sâm bố chính

Trong nghiên cứu này, nhằm tăng khả năng nảy mầm nên các hạt sâm đều được xử lý bằng GA3 trước khi nuôi cấy ở các nồng độ khác nhau. Sau 20 ngày nuôi cấy, các mẫu hạt được tiền xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch GA3 ở các nồng độ từ 10 – 30 mg/L đều thu được tỷ lệ hạt nảy mầm cao hơn so với mẫu không xử lý với GA3 trước đó hoặc xử lý với GA3 ở nồng độ cao (40 mg/L), và tỷ lệ hạt nảy mầm đạt cao nhất (82%) ở nồng độ 20 mg/L GA3.

Kết quả thu được cho thấy nồng độ GA3 ảnh hưởng đến tỷ lệ nảy mầm của hạt. Phan Duy Hiệp và ctv. (2014) cũng báo cáo, tiền xử lý hạt sâm bố chính với dung dịch GA330 mg/L trong thời gian 120 phút, đã giúp nâng cao tỷ lệ nảy mầm của hạt (55,60%).

Bảng 1: Ảnh hưởng của nồng độ GA3 tiền xử lý đến khả năng nảy mầm của hạt sâm bố chính

Hình 3: Ảnh hưởng của nồng độ GA3 tiền xử lý đến khả năng nảy mầm của hạt sau 20 ngày nuôi cấy
A; B; C; D; E tương ứng với nồng độ GA3: 0; 10; 20; 30; 40 mg/L

Ngoài ra, GA3 cũng ảnh hưởng đến chiều cao của cây thu được. Ở nghiệm thức hạt không được tiền xử lý với GA3, cây thu được có chiều cao thấp hơn hẳn so với các nghiệm thức có xử lý với GA3 (Hình 3). Như vậy, tiền xử lý hạt với GA3 (20 mg/L) giúp nâng cao tỷ lệ nảy mầm cũng như chiều cao của cây con.

3.3 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi sâm bố chính

Nhân nhanh chồi là một giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống tạo ra số lượng lớn cây in vitro. Các thể chồi sau khi hình thành có khả năng tiếp tục hình thành chồi với số lượng và chất lượng phụ thuộc rất nhiều vào môi trường nuôi cấy. 

Trong nghiên cứu này, khi bổ sung BA vào môi trường nuôi cấy từ 0 - 2 mg/L thì số lượng chồi/mẫu tăng từ 1,20 lên 6,60 chồi/mẫu và chiều cao chồi cũng tăng từ 2,28 lên 3,28 cm. Tuy nhiên, nồng độ BA cao cũng gây ức chế sự phát triển của chồi, nên khi tăng nồng độ BA lên 3 - 4 mg/L thì số lượng chồi và chiều cao chồi giảm xuống (Bảng 2, Hình 4).
Bảng 2: Ảnh hưởng của BA lên khả năng nhân nhanh chồi sau 45 ngày nuôi cấy

Hình 4: Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi của sâm bố chính sau 45 ngày nuôi cấy
A; B; C; D; E tương ứng với nồng độ BA: 0; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 mg/L

3.4 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây sâm bố chính


Tạo rễ là bước cuối cùng trong quy trình tạo cây in vitro hoàn chỉnh. Có nhiều loại auxin được sử dụng trong giai đoạn tạo rễ, trong đó NAA là một loại auxin tổng hợp và có hoạt tính mạnh được ứng dụng nhiều trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhiều nghiên cứu cũng đã báo cáo, sử dụng NAA thích hợp cho giai đoạn ra rễ tạo cây con hoàn chỉnh, như nghiên cứu của Vũ Hoài Sâm và ctv. (2016) khi tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro cây bách hợp (Lilium brownii F.E. Brown) cũng đã chỉ ra rằng trong môi trường có bổ sung 1,0 mg/L NAA cho kết quả tạo rễ tối ưu nhất. Trên đối tượng cây hà thủ ô đỏ, Lin et al., 2003 cũng nhận thấy nếu bổ sung NAA vào môi trường thì sau 45 ngày nuôi cấy tỷ lệ mẫu tạo rễ là tối ưu nhất 97%.


Trong nghiên cứu này, kết quả thu được cho thấy, số lượng rễ phụ thuộc vào nồng độ NAA bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Ở nghiệm thức đối

chứng, mẫu chồi vẫn tạo rễ, tuy nhiên số lượng rễ tạo ra thấp (6,6 rễ/mẫu), hình thái rễ mảnh với chiều dài trung bình là 13,6 cm, cây yếu và ít lá (Hình 5A). Khi tăng nồng độ NAA từ 0,5 đến 1,5 mg/L thì số lượng rễ/mẫu cũng tăng dần lên và số lượng rễ đạt cao nhất ở nồng độ 1,5 mg/l với 34,8 rễ/mẫu; tuy nhiên, ở nồng độ NAA 1,5 mg/L rễ thu được ngắn hơn so với nồng độ 0,5 và 1,0 mg/L. Nếu tiếp tục tăng nồng độ NAA lên 2,0 mg/L thì số lượng rễ giảm (22,0 rễ/mẫu), đồng thời cây phát triển kém, thấp hơn so với các nghiệm thức khác. Ở nồng độ 1,0 mg/L NAA thu được 33,6 rễ/mẫu và chiều dài là 13,0 cm, rễ tạo ra dày, to, khỏe mạnh, đồng thời cây xanh, khoẻ mạnh (Bảng 3, Hình 5). Do đó, nồng độ NAA 1,0 mg/L được chọn là phù hợp cho quá trình hình thành rễ tạo cây hoàn chỉnh ở cây sâm bố chính.

Bảng 3: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của sâm bố chính

Hình 5: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ của sâm bố chính
A; B; C; D; E tương ứng với nồng độ NAA: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/L

4 KẾT LUẬN

NaClO 15% thích hợp cho quá trình khử trùng hạt và đốt thân sâm bố chính để thu nhận nguồn mẫu in vitro, với thời gian khử trùng là 15 phút. Tiền xử lý hạt với dung dịch GA3 ở nồng độ 20 mg/L trong 120 phút giúp nâng cao tỷ lệ nảy mầm và chiều cao của cây con. Môi trường thích hợp cho quá trình nhân nhanh chồi sâm bố chính là môi trường MS có bổ sung 2 mg/L BA, 30 g/L sucrose, 100 mL/L nước dừa, pH 5,8. Môi trường thích hợp cho quá trình phát sinh rễ tạo cây con hoàn chỉnh là MS có bổ sung 1 mg/L NAA, 30 g/L sucrose, 8 g/L agar, pH 5,8

Tác giả

Trịnh Thị Hương1*, Võ Phan Nhật Khang1, Lê Trương Minh Châu1, Vạn Minh Hiệu1 và

Trần Trọng Tuấn2

1Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh

2Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh

Lúc Invitro Thực Vật

Thứ Ba, 24 tháng 5, 2022

Bảng giá môi trường MS: Loại pha sẵn Vs. đơn lẻ

Bảng giá môi trường MS: Loại pha sẵn Vs. đơn lẻ

Môi trường MS Murashige & Skoog medium là một môi trường thông dụng trong nuôi cấy mô thực vật. MS được sáng chế bởi Prof. Toshio Murashige và Skoog Folke K. vào năm 1962 trong quá trình tìm kiếm chất sinh trưởng mới của Murashige.

Trong nuôi cấy sản xuất thì vấn đề chi phí rất quan trọng. Do đó, SBC SCIENTIFIC sẽ đưa ra 2 bảng so sánh giá thành giữa môi trường MS pha sẵn Duchefa so với môi trường MS đơn lẻ của Duchefa; Môi trường MS pha sẵn Duchefa so với môi trường MS đơn lẻ của Trung quốc.

Bảng so sánh giữa môi trường MS tích hợp Duchefa Vs. môi trường MS riêng lẻ Duchefa


Bảng so sánh giữa môi trường MS tích hợp Duchefa Vs. môi trường MS riêng lẻ Trung quôc


Có một số chất như KNO3, NH4NO3 Duchefa không nhập được, nên có thể thay thế bằng các hãng khác như Fisher, và Trung quốc.

Từ bảng so sánh trên, nhà nghiên cứu, sản xuất có thể đưa ra quyết định đầu tư phù hợp với mình. Đây chỉ là môi trường cơ bản trong nuôi cấy mô, ngoài ra còn rất nhiều môi trường pha sẵn tích hợp khác như gamborg B5, Knudson C Orchid, White medium, Chu medium, Vacin went….

Lúc Invitro Thực Vật

Thứ Bảy, 9 tháng 4, 2022

Môi trường nuôi cấy Sâm ngọc linh pha sẵn

Tìm hiểu môi trường nuôi cấy Sâm ngọc linh dạng tích hợp sẵn. 

Môi trường MS là môi trường phổ biến dùng cho rất nhiều loại cây trong đó có Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv). Nhưng môi trường thích hợp nhất cho việc nuôi cấy Sâm Ngọc Linh đó là môi trường SH (SCHENK & HILDEBRANDT BASAL SALT MEDIUM)



Chọn lựa môi trường nuôi cấy quyết định đến sự thành công của quá trình nuôi cấy. Sau nhiều chọn lọc nghiên cứu thì người ta đúc kết ra được môi trường SH cho ra kết quả đẹp nhất, trong nhiều nghiên cứu nó được sử dụng rộng rãi để nuôi các tế bào trong dung dịch huyền phù.

Trong thành phần môi trường SH, Potassium Nitrate (KNO3) được xem là nguồn cung cấp nito quan trọng. Môi trường SH dạng pha sẵn của Duchefa Hà lan, mã S0225 có đầy đủ các khoáng vi lượng, đa lượng. Cần bổ sung thêm vitamins SH, đường, agar, và các loại hormone. Các hormone phổ biến được áp dụng cho quá trình nuôi cấy bao gồm 2.4D, IBA, Kinetin, BAP, NAA

Tham khảo sản phẩm 

1. Môi trường Schenk & Hilderandt basalt Salt medium

Lúc Invitro Thực Vật

Môi trường MS pha sẵn tiện lợi như thế nào?

Trong ngành nuôi cấy mô thực vật thì môi trường MS (Murashige and Skoog medium) là một môi trường được biết đến rộng rãi và thường xuyên được sử dụng. Lợi ích của việc sử dụng môi trường MS pha sẵn (MS tích hợp) như thế nào sẽ được trình bày trong bài viết này.



Môi trường MS do ông Toshio Murashige và Skoog Folke K phát mình ra vào năm 1962 trong quá trình tìm kiếm chất sinh trưởng mới của Murashige. Các lý do mà MS được sử dụng rộng rãi từ đó đến nay như:

  1. Môi trường MS pha sẵn cung cấp đầy đủ dưỡng chất mà đa số các loại cây đòi hỏi. Để tối ưu hóa cho từng cây riêng lẻ thì người ta đã thêm hoặc bớt các thành phần trong MS, ví dụ như MS bổ sung vitamins, MS bổ sung vitamins SH, vitamins B5. Cho đến hiện nay thì có rất nhiều môi trường khác ngoài MS như Knudson C, Gamborg, CHU (N6) medium, Vacin and Went, White medium, Nitsch medium, Orchimax, WPM…
  2. Môi trường MS dạng tích hợp rất tiện lợi, nó đã chứa sẵn các thành phần cần thiết mà không cần chúng ta phải pha chế như cách truyền thống. Môi trường MS tích hợp có thể ở dạng cơ bản và ở dạng bổ sung thêm vitamins. Mỗi lần pha chỉ cần lấy từ hủ pha sẵn đó, hòa tan với nước để sử dụng.
  3. Tỉ lệ pha chuẩn trong môi trường MS tích hợp. Hãng Duchefa nổi tiếng trong ngành nuôi cấy mô thực vật, họ đã có hơn 30 năm kinh nghiệm trong ngành nuôi cấy mô. Mỗi mẻ pha chế sử dụng công nghệ hiện đại, với dây chuyền máy móc tự động, do đó, tỉ lệ sử dụng rất chính xác.
  4. Môi trường MS dạng tích hợp rất dễ bảo quản và vận chuyển. Nó ở dạng bột được lưu trữ trong hủ nhựa, chúng ta có thể bảo quản nơi thoáng mát như các hóa chất thông thường khác. Một hủ nhỏ có thể dùng pha cho từ 50L-100L, do đó, nó có thể được vận chuyển bất cứ nơi đâu do tính nhỏ gọn của nó.
  5. Độ pH của môi trường MS đã được hiệu chuẩn, nếu không xài hormone bổ sung thì chúng ta không cần chuẩn độ pH nữa.
  6. Nếu sử dụng quy cách lớn từ 100L – 500L thì giá thành của nó rất rẻ so với các chúng ta tự pha.

Tham khảo chi tiết sản phẩm: 


Lúc Invitro Thực Vật

Thứ Tư, 3 tháng 11, 2021

Cách hòa tan NaOH

 Hướng dẫn cách pha dung dịch NaOH 1N từ NaOH bột. Chúng ta sẽ áp dụng công thức Cm=n/V, trong đó n=m/M.

Vậy chúng ta có Cm=m/(M x V) => m= Cm x M x V.

GIả sử nồng độ ở đây là 1N, thể tích là 1L; M của NaOH là 40. Do đó, ta cần lấy m= 1 x 40 x1 = 40g của NaOH

Lưu ý: Bỏ 850ml nước vào trước, rồi cho 40g NaOH, cuối cùng làm đầy cho 1L nước.

Công thức trên áp dụng tùy ý thích của như thể tích cần thiết và nồng độ cần thiết.

Ví dụ pha NaOH 10M, thể tích là 100ml. Tương tự như trên, ta áp dụng m= Cm x M x V= 10 x 40 x 0.1 = 40 g

Bảng một tra một số nồng độ phổ biến

Lúc Invitro Thực Vật

Thứ Bảy, 7 tháng 8, 2021

Nuôi Cấy in vitro Kiểng lá Monstera deleciosa

Tìm hiểu về về Monstera deliciosa 

Chi Monstera bao gồm 22 loài và chủ yếu được trồng để lấy lá làm cảnh. Những cây này giống với loài Philodendrons. Trong bài viết này, chúng tôi sẽ giới thiệu sơ lược về loài Monstera deliciosa và cách chúng được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô.

Monstera deliciosa còn được gọi là cây pho mát Thụy Sĩ vì có các lỗ trên lá của nó. Từ “Monstera” trong tên đề cập đến kích thước lớn của thực vật, có thể phát triển lên đến 30 ft., Và “deliciosa” dùng để chỉ các loại trái cây ăn được.

Phân bố và môi trường sống:

Nó có nguồn gốc từ các khu rừng nhiệt đới của Trung Mỹ và miền nam Mexico. Nó cũng được đưa vào một số khu vực nhiệt đới khác và nổi tiếng là loài thực vật xâm lấn ở những nơi như Hawaii, Seychelles, Đảo Ascension và Quần đảo Society.

Lá và rễ:

Là cây nho leo lên thân cây nhờ sự trợ giúp của bộ rễ dày trên không và bao phủ hoàn toàn cây leo bằng những chiếc lá rộng. Rễ trên không không chỉ giúp cây leo mà còn giúp lấy nước và chất dinh dưỡng.

Monstera deliciosa thuộc họ Ráy và là một loại cây trồng phổ biến trong nhà. Nó có rễ trên không có thể phát triển lên đến 20 mét. Lá của cây to, nhiều da, bóng, hình trái tim, dài từ 25 đến 90 cm, rộng từ 25 đến 75 cm.

Cụm hoa của cây là một nửa hình bầu dục màu trắng (một lá lớn bao quanh cụm hoa của cây) với hình bông dài (cụm hoa dạng cành với những hoa nhỏ hiện diện trên một thân cây có nhiều thịt) ở giữa. Ở giai đoạn trưởng thành, spadix phát triển thành quả màu trắng có thể ăn được.

Nuôi cấy mô kiểng lá

Nuôi cấy mô là một phương pháp hiệu quả và phổ biến để nhân giống hàng loạt các cây có giá trị công nghiệp hoặc thương mại, và cây Monstera deliciosa được trồng để lấy lá đã cắt của cây.

Video cho thấy quy trình nuôi cấy Monstera deliciosa trong phòng thí nghiệm. Các bước tiếp theo được thảo luận trong phần bên dưới.

Vật liệu cần thiết

Chồi non của Monstera deliciosa, dao vô trùng, bàn chải nhỏ, máy khuấy từ, xà phòng rửa bát, beach 1%, chất hoạt động bề mặt, tween 20, hydrogen peroxide 3%, giấm, axit axetic, kẹp vô trùng, môi trường chứa chai nuôi cấy, parafilm và nhãn .

Quy trình khử trùng

  1. Lấy các chồi non của cây và cẩn thận loại bỏ đất để lộ rễ và thân rễ.
  2. Cắt cây theo kích thước nhỏ hơn bằng dao hoặc dụng cụ cắt tỉa vô trùng.
  3. Đặt mẫu đã cắt dưới vòi nước chảy để loại bỏ càng nhiều chất bẩn càng tốt trên mẫu.
  4. Lấy một bàn chải nhỏ và làm sạch rễ.
  5. Hòa xà phòng rửa bát vào nước máy và đặt que cấy vào dung dịch xà phòng đã chuẩn bị trong tối đa một giờ. Dùng máy khuấy từ để làm sạch kỹ mẫu cấy.
  6. Sau một giờ, lấy mẫu ra và cắt tỉa tất cả các lá dính trên nó.
  7. Lấy một cốc hoặc hộp chứa có mỏ và thêm 3 ml thuốc tẩy vào 300 ml nước cất (bạn cần chuẩn bị dung dịch 1%). Sau đó thêm chất hoạt động bề mặt và một vài giọt tween 20. Dung dịch khử trùng của bạn đã sẵn sàng!
  8. Bây giờ đặt các mẫu cấy vào dung dịch khử trùng trong một giờ mà không làm phiền.
  9. Sau một giờ, tráng mẫu bằng H2O2 3% trong năm phút.
  10. Vào phút cuối cùng, thêm 2% thể tích giấm làm sạch với 3% hydrogen peroxide. (Trong video, 3 ml giấm được thêm vào 150 ml hydrogen peroxide). Hydro peroxit và axit axetic tạo thành chất oxy hóa rất mạnh và là dung dịch khử trùng rất hiệu quả.
  11. Dùng kẹp vô trùng loại bỏ phần mô chết xung quanh rễ (nếu có).
  12. Sau đó, đặt mẫu cấy lên môi trường nuôi cấy để đảm bảo mẫu tiếp xúc chắc chắn với môi trường.
  13. Đậy kín các chai nuôi cấy có chứa mẫu cấy bằng cách sử dụng màng bọc parafilm hoặc saran và dán nhãn hộp chứa tên cây và ngày nuôi cấy.
  14. Tiếp tục quan sát các mẫu cấy của bạn và sau hai tuần, nếu bạn thấy giá thể cạn kiệt, bạn có thể cấy cây con và chuyển chúng sang môi trường mới.
  15. Sau một vài tuần nữa, với sự chăm sóc thích hợp, các mẫu cấy sẽ sẵn sàng để chuyển sang đất trong chậu nhỏ và sau đó sang chậu lớn hơn.
Video 1
Video 2


Môi trường nuôi cấy Monstera deliciosa

Phương pháp chuẩn bị môi trường mô thực vật Monstera deliciosa áp dụng công nghệ nuôi cấy mô, môi trường khác biệt được điều chế bằng cách thêm hormone 6-benzyl aminopurine (6BAP) và axit 1-naphthaleneacetic (NAA) trong môi trường Murashige và Skoog (MS), được sử dụng để nhân giống Monstera deliciosa theo cách thức chồi chùm và góp phần duy trì các đặc tính mong đợi.

Môi trường tạo rễ được chuẩn bị bằng cách thêm axit 1-naphthaleneacetic(naa) và than hoạt tính trong môi trường tối thiểu 1/2 MS và có thể được sử dụng để cải thiện chất lượng rễ.

Lúc Invitro Thực Vật

Thứ Ba, 18 tháng 5, 2021

Bảng thành phần môt trường Knudson C

 Bảng thành phần môi trường Knudson C dùng để cho nuôi cấy Lan. Cùng tìm hiểu môi trường Knudson C là gì, do ai phát triển? Và nơi cung cấp môi trường Knudson C chất lượng



Hoa lan có lẽ đã được thụ phấn bằng tay lần đầu tiên vào năm 1797–1799 bởi nhà thực vật học người Đức, J. K. Wachter. Mô tả sớm nhất về cây con phong lan (Orchis morio và Bletia verecunda), là của nhà thực vật học người Anh, R. A. Salisbury, trong một bài báo được giao năm 1802 và xuất bản năm 1804.


Sự nảy mầm của một loài phong lan (Prescottia plantaginea) trong một cơ sở làm vườn ban đầu được báo cáo từ vườn Hiệp hội làm vườn tại Chiswick, Vương quốc Anh vào năm 1822 hoặc 1832.


Tuy nhiên, báo cáo chi tiết và có căn cứ đầu tiên về chủ đề này đã được xuất bản bởi D. Moore, Giám đốc Vườn Bách thảo Glasnevin ở Ireland vào năm 1849. Điều này dẫn đến việc lai tạo phong lan đầu tiên được tạo ra bởi J. Dominy của Messrs Veitch & Sons of Exeter , Vương quốc Anh vào năm 1856.


Năm mươi năm sau, nhà thực vật học người Pháp Noel Bernard đã khám phá ra vai trò của nấm rễ trong sự nảy mầm của hạt phong lan. Phương pháp nảy mầm không cộng sinh của hạt phong lan được đưa ra bởi nhà sinh lý học thực vật người Mỹ L. Knudson.


Nỗ lực đầu tiên để nhân giống lan (Phalaenopsis) bằng phương pháp nuôi cấy mô được thực hiện bởi G. Rotor tại Đại học Cornell. Phương pháp nuôi cấy ngọn chồi cho hoa lan, do G. Morel ở Pháp phát triển vào năm 1960, sử dụng các kỹ thuật được sử dụng cho Tropaeolum và Lupinus của E. A. Ball ở Hoa Kỳ vào đầu năm 1946.


Thành phần trong môi trường Knudson C là gì?

Hoa lan phát triển chậm và tạo ra tương đối ít nhánh con hoặc nhánh phụ có thể được sử dụng để nhân giống sinh dưỡng. Điều này đặc biệt đúng đối với các loài lan đơn thân như Phaluenopsis mặc dù sự hiện diện của các chồi bên trên cuống hoa của chúng. Các nỗ lực đã được thực hiện ở Anh, Pháp, Brazil và các nơi khác để sử dụng những nút cuống hoa này để nhân giống vô tính (Anonymous, 1891c, 1892; Shara, 1938, 1952; Horick, 1966; Tews, 1974; Reisinger, Ball & Arditti, 1976 ).


Các phương pháp này giống với các quy trình nuôi cấy mô hiện tại vì các phần thân cây được ‘nuôi cấy’ trên một chất nền như rêu. Họ không thành công lắm và phần lớn đã bị lãng quên.


Nỗ lực phát triển các phương pháp nhân giống vô tính cho lan Hồ điệp đã được đổi mới ngay sau khi môi trường Knudson C được công bố. Rotor, một sinh viên trong phòng thí nghiệm của Knudson, đã đặt các phần cuống hoa, mỗi phần chứa một nút, trên môi trường C và thu được các cây con (Rotor, 1949). Mặc dù không thành công đồng đều, đây dường như là lần đầu tiên sử dụng phương pháp nuôi cấy mô hoặc cơ quan để nhân giống thương mại thực vật nói chung và hoa lan nói riêng.


Mỗi nút chỉ tạo ra một cây con và tốt nhất có thể thu được một số cây từ một chùm hoa. Do đó, quy trình này không thể được sử dụng rộng rãi để nhân giống vô tính nhanh chóng.


Nền tảng của các phương pháp nhân giống vô tính nhanh hàng loạt hiện nay thông qua nuôi cấy mô phân sinh (thực sự là chồi ngọn) (‘mericloning’) được đặt ra vào năm 1946, khi Ball (1946) báo cáo về việc nuôi cấy các ngọn chồi của Tropueolum và Lupinus. Các phương pháp này sau đó đã được Morel ở Pháp sử dụng để nuôi cấy các chồi hoa lan và điều này đã tạo ra một cuộc cách mạng trong ngành công nghiệp hoa lan (Arditti, 197713).


Bảng thành phần môi trường Knudson C


Nơi cung cấp môi trường Knudson C

SBC SCIENTIFIC
Hotline: 0945677929

Lúc Invitro Thực Vật
Đăng ký: Bài đăng (Atom)